河南农业科学，２０１３，４２（４）：１１—１３，ｌ８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因检测技术研究进展 郭晓琴 ，孙红正 （１．中州大学，河南郑州４５００４４；２．河南农业大学，河南郑州４５０００２） 摘要：ｍｉｃｒｏＲＮＡ是真核生物基因表达调控的重要因子，对其靶基因的验证是研究ｍｉｃｒｏＲＮＡ功 能必不可少的环节。验证ｍｉｃｒｏＲＮＡ与其靶基因的相互作用，可以根据能否进行靶基因切割、能 否造成目标靶基因ＲＮＡ表达量或蛋白表达量降低以及能否形成ＲＩＳＣ—ｍＲＮＡ复合体等特征进 行检测。基于此，从以上三方面对验证ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因的技术进行了综述。 关键词：ｍｉｃｒｏＲＮＡ；５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ；ｔａｒｇｅｔ－ｍｉｍｉｃ；靶基因；降解组；免疫共沉淀 中图分类号：Ｑ３４１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４—３２６８（２０１３）０４—００１１一Ｏ４ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ ＧＵＯ Ｘｉａｏ—ｑｉｎ ，ＳＵＮ Ｈｏｎｇ－ｚｈｅｎｇ。 （１．Ｚｈｏｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００４４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｉｓ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅ．Ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔＯ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔＯ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ，ｔｈｅ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒ— ｇｅｔ ｇｅｎｅ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＩＳＣ—ｍＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｖｅｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ａｒｅａｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ；５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ；ｔａｒｇｅｔ—ｍｉｍｉｃ；ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ；ｄｅｇｒａｄｏｍｅ；ｃｏｉｍｍｕｎｉｐｒｅｃｉｐｉ— ｔａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ是广泛存在于真核生物体内的一类 ＮＡ的研究中，计算机辅助预测和试验验证是最常 ２１～２４ ｎｔ的短片段非编码ＲＮＡ［１］，作为一类新发 用的研究技术，预测采用的软件（如ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ ］， 现的基因表达调控因子，在维持基因组稳定性、调节 ｐｓＲＮＡＴａｒｇｅｔＬ６ 等）会根据ｍｉｃｒｏＲＮＡ序列与目标 生长发育和生物与非生物胁迫等生物过程中都起着 靶基因序列结合自由能以及经验模型预测出特定 重要的作用 ］。目前，已经在１９３个物种中发现 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的靶基因结合位点，但计算机辅助预测 ２５ ２１４个ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅ，Ｒｅｌｅａｓｅ １９）。在植 存在假阳性，ｍｉｃｒｏＲＮＡ是否能切割靶基因最终仍 物中，ｍｉｃｒｏＲＮＡ由２类ＲＮＡ聚合酶转录相应的 需试验验证＿７ ］。鉴于此，综述了ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基 Ｍ侬基因，转录本经过自身折叠和ＤＣＬ１、ＨＥＮ１ 因的试验验证技术，以期为ｍｉｃｒｏＲＮＡ相关研究提 等酶类的切割加工后成为成熟的ｍｉｃｒｏＲＮＡ［４］。成 供参考和借鉴。 熟后的ｍｉｃｒｏＲＮＡ与ＡＧＯ蛋白结合，通过碱基配 对原则与其靶基因结合，从而造成靶基因切割、阻遏 直接检测ｍｉ．ｃｒｏＲＮＡ切割位点 翻译以及甲基化等基因负调控效应。在对ｍｉｃｒｏＲ— 在植物中，靶基因的切割是ｍｉｃｒｏＲＮＡ最主要 收稿日期：２０１２—１１一Ｏ９ 基金项目：国家青年科学基金资助项目（３１２００９７３） 作者简介：郭晓琴（１９８０一），女，河南周口人，硕士，主要从事生物分子遗传研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｌａｍｏｕｒ８０＠ｔｏｍ．ｔｏｍ ＊通讯作者：孙红正（１９７９一），男，河南平顶山人，讲师，博士，主要从事作物分子生理研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｕｎｈｏｎｇｚｈｅｎｇ＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ １２ 河南农业科学 第４２卷 的作用方式，其作用结果是靶基因ｍＲＮＡ被ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡ—ＲＩＳＣ复合体在靶位点切断【９］。采用 ＲＮＡ连接酶介导的５ ＲＡＣＥ（５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ）方 法可以检测被切断的靶基因ｍＲＮＡ，而其做法区别 于常规５ ＲＡＣＥ。５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ先用ＲＮＡ连接 酶在ｍＲＮＡ的５ 端加上一个ＲＮＡ接头（ａｄａｐｔｏｒ）， 然后用接头特异引物和基因特异引物反转录后进行 ＰＣＲ扩增，然后克隆、测序鉴定切割位点。被ｍｉ－ ｃｒｏＲＮＡ—ＲＩＳＣ复合体切断的ｍＲＮＡ有别于完整 的ｍＲＮＡ，后者有５ 帽子结构，所以不能连接ＲＮＡ 接头，在反转录后ＰＣＲ中不能被扩增。被切割的 ｍＲＮＡ相对于随机断裂的ｍＲＮＡ，其切割位点是 固定的，因此，在５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ结果中，沿ｍＲＮＡ 序列随机断裂位点呈随机分布，而在切割位点处呈 现出异常高的克隆频次。这种５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ方 法在单个ｍｉｃｒｏＲＮＡ研究中已被广泛应用并被证 明是有效的［１ ”］。 随着测序技术的发展，大规模的ＤＮＡ测序已 经成为可能，在２００８年出现了在转录组水平进行 ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因切割位点的ＰＡＲＥ（ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｅｎｄｓ）技术［１引，也被称为降解组测 序（ｄｅｇｒａｄｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。ＰＡＲＥ技术与 ５ ＲＬＭ—ＲＡＣＥ类似，也要在ｍＲＮＡ的５’端加一个 ＲＮＡ接头，不同的是ＰＡＲＥ技术富集所有含 ＰｏｌｙＡ的ｔｕＲＮＡ，并且在ＲＮＡ接头上有一个内切 酶Ｍｉｎｅ Ｉ识别位点，该内切酶切割位点位于其识别 位点下游２Ｏ ｂｐ处，加接头的ｍＲＮＡ反转录成 ｅＤＮＡ，用Ｍｉｎｅ Ｉ酶切后加上一个ＤＮＡ接头，根据 两侧接头的序列设计引物，经ＰＣＲ扩增后克隆建库 进行深度测序，测序后得到２Ｏ ｂｐ的序列，然后通过 生物信息学分析比对到原ｍＲＮＡ转录本上，在 ｍｉｃｒｏＲＮＡ切割位点处会出现高频的次数分布，区 别于随机断裂的位点。采用降解组测序方法鉴定 ｍｉｃｒｏＲＮＡ切割靶基因位点已在多个物种上得到应 用［１４－１８］。 ２ 在ＲＮＡ水平或蛋白质水平检测靶 基因的表达量 ｍｉｃｒｏＲＮＡ调控基因的最终结果是基因表达量 降低，其具体表现就是在ＲＮＡ水平上转录本的减 少或蛋白质水平上翻译量的减少，特别是对于翻译 阻遏效应来说，ｍｉｃｒｏＲＮＡ并不直接降解ｍＲＮＡ， 而是结合到ｍＲＮＡ上造成翻译阻遏，所以，此类调 控并不减少ＲＮＡ转录本的数量，在蛋白质水平上 进行检测更能说明其调控效果。通过检测表达量变 化来确定ｍｉｃｒｏＲＮＡ与靶基因关系的方法主要有 ｑＲＴ—ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交、２一Ｄ蛋白电泳等，但是 需要构建ｍｉｃｒｏＲＮＡ超表达或干扰表达的转基因 系，通过ｍｉｃｒｏＲＮＡ量的变化确定目标靶基因的变 化趋势，从而验证两者之间的调控关系。在构建转 基因系研究中，超表达ｍｉｃｒｏＲＮＡ相对容易，只需 将ｍｉｃｒｏＲＮＡ前体基因插入强启动子之后导入细胞 即可实现。但常规干扰编码基因的ＲＮＡｉ方法不能 直接用于降低或干扰ｍｉｃｒｏＲＮＡ表达，Ｆｒａｎｃｏ— Ｚｏｒｒｉｌｌａ等Ｌ１ 设计了ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ—ｍｉｍｉｃ模拟 ＤＮＡ片段，ｔａｒｇｅｔ—ｍｉｍｉｃ片段与ｍｉｃｒｏＲＮＡ相比在 第１Ｏ位与第１１位多出一个碱基，其他碱基位置与 ｍｉｃｒｏＲＮＡ完全互补，这样的模拟物与ｍｉｃｒｏＲＮＡ 只能结合但不能被ＲＩＳＣ复合体切割，所以造成ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡ虽然表达，但由于被模拟物结合，不能作用 于其靶基因。Ｙａｈ等［２叩又将这种ｔａｒｇｅｔ—ｍｉｍｉｃ的 方法进行改进，设计２个ｔａｒｇｅｔ－ｍｉｍｉｃ通过４８ ｂｐ 的ｓｐａｃｅｒ序列相连，其抑制相应ｍｉｃｒｏＲＮＡ的效果 明显增强。与野生型相比，靶基因由于受到ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡ的调控消除或减弱，其表达量和蛋白表达 产物如果高于野生型，ｍｉｃｒｏＲＮＡ与靶基因的调控 关系就得到验证。 另外一种检测ｍｉｃｒｏＲＮＡ负调控靶基因的方 法是利用ｌｕｃｉ ｒａｓｅ报告基因作为指示标记来检测 ｍｉｃｒｏＲＮＡ对靶基因的降解作用Ｌ２¨。其做法是将 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的靶基因序列片段克隆到ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基 因编码区终止密码子之后，但是位于转录终止加 ｐｏｌｙＡ信号之前，之后将构建好的克隆载体和 ｍｉｃｒｏＲＮＡ同时导人真核细胞，ｌｕｃｉ’ｆｅｒａｓｅ报告基因 在启动子驱动下转录表达，如果ｍｉｃｒｏＲＮＡ能作用 于靶基因序列，转录本被切割降解，将检测不到 ｌｕｃｉ ．Ｋａｓｅ报告基因的表达。反之，如果ｍｉｃｒｏＲＮＡ 不能作用于靶基因序列，则会检测到报告基因的 表达。 ３ 检测ｍｉｃｒｏＲＮＡ与靶基因ｍＲＮＡ 的结合 ｍｉｃｒｏＲＮＡ对靶基因的调控作用依赖于 ｍｉｃｒｏＲＮＡ与ＡＧＯ蛋白结合，并招募其他蛋白形成 ＲＩＳＣ复合体才能对ｍＲＮＡ靶序列切割或阻遏，据 此将ＡＧＯ蛋白与一抗原决定基相连，用免疫共沉 淀方法分离得到ｍｉｃｒｏＲＮＡ—ＡＧＯ—ｍＲＮＡ的复 合体，以此来富集与ｍｉｃｒｏＲＮＡ相互作用的ｍＲＮＡ 序列，然后通过ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、深度测序等方法得到 ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因信息或作用位点序列［ｚｚ－ｚａ］。与此 第４期 郭晓琴等：ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因检测技术研究进展 Ｒｎａ，２００４，１０（１０）：１５０７—１５１７． 类方法类似的有高通量紫外交联免疫沉淀法 （ＨＩＴＳ—ＣＬＩＰ）［２‘ 和光激活核酸加强交联免疫共 沉淀法（ＰＡＲ—ＣＬＩＰ）Ｌ２ 。 ［６］ Ｄａｉ Ｘ，Ｚｈａｏ Ｐ Ｘ．ｐｓＲＮＡＴａｒｇｅｔ：ａ ｐｌａｎｔ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｅｒｖｅｒ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１１，３９： ５—９． Ｏｒｏｍ等［２ 等设计了另外一种分离ｍｉｃｒｏＲＮＡ— ｍＲＮＡ结合体的方法。首先在体外人工合成 ｍｉｃｒｏＲＮＡ的正反２条链，并将正义链３ 端用生物 ｌ Ｇ Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ— ［７］ Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｄ Ｗ，Ｂｒａｃｋｅｎ Ｃ Ｐ，Ｇｏｏｄａｌｔａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１１，３９（１６）：６８４５—６８５３． 素进行标记，将人工双链ｍｉｃｒｏＲＮＡ片段导人合适 的细胞中，之后生物素标记的ｍｉｃｒｏＲＮＡ进入 ＲＩＳＣ复合体并与靶基因结合，此时利用链霉素与生 物素的亲和性将结合了靶基因的复合体分离出来， 然后用ｑＲＴ—ＰＣＲ或ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ方法对分离得到 的ｍＲＮＡ进行分析。 ４ 展望 近年来ｍｉｃｒｏＲＮＡ作为新发现的一类基因表 达调控因子，对其研究已成为生命科学的热点。目 前，通过大规模深度测序，新ｍｉｃｒｏＲＮＡ的发现相 对来说比较容易，进行ｍｉｃｒｏＲＮＡ下游靶基因的研 究是探索基因调控网络必不可少的，但也相对比较 困难，仅依靠生物信息学预测远远不够，必须依靠试 验验证。ｍｉｃｒｏＲＮＡ不仅可以对靶基因进行切割、 翻译阻遏，也可以改变ＤＮＡ水平上的甲基化从而 改变基因表达模式，因此，任何单种检测方法在实际 应用中都有其优缺点。Ｙａｎｇ等［２。 将水稻大规模测 序验证的ｍｉｃｒｏＲＮＡ切割位点降解组数据建成数 据库以供水稻ｍｉｃｒｏＲＮＡ研究参考和借鉴，ｍｉ－ ｃｒｏＲＮＡ是否有切割位点可以直接在数据库中进行 搜索，用于验证生物信息预测结果。而随着基因组、 转录组、蛋白组、降解组等组学技术的发展，大规模 的靶基因检测技术在以后的研究中应用将会越来越 广，结合生物信息技术，ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因的验证也 将更具针对性。 参考文献： ［１３ Ｃｈｅｎ Ｘ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ Ｉ－Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００５，５７９（２６）：５９２３—５９３１． ［２３ Ｒｕｉｚ—Ｆｅｒｒｅｒ Ｖ，Ｖｏｉｎｎｅｔ ０．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｍａｌ１ ＲＮＡｓ ｉｎ ｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ， ２００９，６０：４８５—５１０． ［３］ Ｂｏｎｎｅｔ Ｅ，Ｖａｎ ｄｅ Ｐｅｅｒ Ｙ，Ｒｏｕｚ６ Ｐ．Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ，２００６，１７１（３）：４５１— ４６８． ［４］ Ｖｏｉｎｎｅｔ ０．Ｏｒｉｇｉｎ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００９，１３６（４）：６９—８７． Ｅ５］ Ｒｅｈｍｓｍｅｉｅｒ Ｍ，Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｍ，Ｈｏｃｈｓｍａｎｎ，ｅｔ ａ１．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｅｒｏＲＮＡ／ｔａｒｇｅｔ ｄｕｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］． ［８３ Ｋｕｈｎ Ｄ Ｅ，Ｍａｒｔｉｎ Ｍ Ｍ，Ｆｅｌｄｍａｎ Ｄ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｅｒｉ— ｍｅｎｔａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００８，４４（１）：４７—５４． ［９］ Ｍａｌｌｏｒｙ Ａ Ｃ，Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ Ｈ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００６， ３８（Ｓｕｐｐ１）：３１—３６． ［１０］ Ｗａｎｇ Ｊ，Ｙａｎｇ Ｘ，Ｘｕ Ｈ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ— ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２０１２，５０５（２）：３００—３０８． ［１１］ Ｓｕｎ Ｘ，Ｋｏｒｉｒ Ｎ Ｋ，Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｍｉｃｒｏＲ１６４ ａｎｄ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ，２Ｏ１２，３９（１０）：９４６３－９４７２． ［１２］ Ｓｏｎｇ Ｃ，Ｙｕ Ｍ，Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒ— ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ，２０１２，５：２３５—２３９． ［１３３ Ｇｅｒｍａｎ Ｍ Ａ，Ｐｉｌｌａｙ Ｍ，Ｊｅｏｎｇ Ｄ Ｈ，ｅｔａ１．Ｇｌｏｂａｌ ｉｄｅｎ— ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ ｐａｉｒｓ ｂｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｅｎｄｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６ （８）：９４１—９４６． ［１４］ Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｚ，Ａｉ Ｘ Ｙ，Ｇｕｏ Ｗ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ｏｒａｎｇｅ（Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ Ｌ．Ｒａｆ）（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１２，５１（１）：４４—５７． ［１５］ Ｘｕ Ｍ Ｙ，Ｄｏｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｑ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｒｏｍ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｂｙ ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１２，１３（１）：４２１—４２８． ［１６］ Ｓｈａｍｉｍｕｚｚａｍａｎ Ｍ，Ｖｏｄｋｉｎ Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙ— ｂｅａｎ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅ— ｃｉｆｉｃ ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ｂｙ ｄｅｇｒａｄｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１２，１３：３１０－３１８． ［１７］ Ｍａｏ Ｗ，Ｌｉ Ｚ，Ｘｉａ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ［Ｊ］．ＰＬｏｓ Ｏｎｅ，２０１２，７（３）： ３３０—３４０． Ｅ１８］ Ｌｉ Ｙ Ｆ，Ｚｈｅｎｇ Ｙ，Ａｄｄｏ—Ｑｕａｙｅ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ— ｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２０１０，６２（５）：７４２—７５９． ［１９］ Ｆｒａｎｃｏ—Ｚｏｒｒｉｌｌａ Ｊ Ｍ，Ｖａｌｌｉ Ａ，Ｔｏｄｅｓｃｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００７，３９：１０３３— １０３７． （下转第１８页） １８ 河南农业科学 第４２卷 ［１９］裴建文，吕汰，柴晓芹，等．天水市蔬菜主产区耕层土 壤养分评价及施肥建议口］．甘肃农业科学，２００２（７）： ３８—４Ｏ． 评价［Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（３）：４３１—４３２． ［３１］解迎革，薛绪掌，王国栋，等．非表层剖面层次土壤生 产力评价研究［Ｊ］．中国生态农业学报，２００６，１４（４）： ５７—６Ｏ． ［２Ｏ］崔云玲，马忠明，杨君林，等．河西绿洲灌区耕层土壤 养分状况评价［Ｊ］．西北农业学报，２０１０，１９（８）：１１６— １２０． ［３２］索东让，杨生茂，孙炳玲，等．河西绿洲灌漠土长期施 肥效应及土壤生产力演变［Ｊ］．干旱地区农业研究， ２００５，２３（６）：５６－６０． 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土壤生产力评价中的应用［Ｊ］．中国农学通报，２０１０， ２６（８）：１７９—１８８． ［３９］孙振宁，谢云，段兴武．生产力指数模型ＰＩ在北方土 壤生产力评价中的应用［Ｊ］．自然资源学报，２００９，２４ （４）：７０８—７１８． ［２８］胡振琪．矿山复垦土壤的物理特性及其在深耕措施下 的改良［Ｄ］．北京：中国矿业大学，１９９１． ［２９］杜海波，吴正方，李明，等．德惠市土壤生产力定量评 价［Ｊ］．东北师大学报：自然科学版，２００３，４３（１）：３２— １３８． ［４Ｏ］叶立新，刘胜龙，贾景丽，等．凤阳山不同群落土壤肥 力质量评价［Ｊ］．林业科技开发，２００９，２３（６）：１７－２０． ［４１３杜长城，弓维钧，张伟玉．两种园田土壤肥力初探［Ｊ］． 天津农业科学，２００７（１）：２９—３０． ［３Ｏ］陆海波，翟琨．恩施州魔芋种植基地土壤生产力质量 （上接第１３页） ［２Ｏ］ Ｙａｎ Ｊ，Ｇｕ Ｙ，Ｊｉａ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｄｅ— ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０，１７（２）：１７３－１７９． Ｓ Ｗ，Ｚａｎｇ Ｊ Ｂ，Ｍｅｌｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ＨＩＴ ［２５］ ＣｈｉＣＬＩＰ ｄｅｃｏｄｅｓ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｍＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｐｓ ｍｉｍｉｃ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０１２，２４（２）： ４１５－４２７． ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０：４７９—４８６． ［２１］ Ｎｉｃｏｌａｓ Ｆ Ｅ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｍｅｔｈ— ｏｄｓ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，２０１１，７３２：１３９－１５２． ［２６３ Ｈａｆｎｅｒ Ｍ，ａｎ＆ｈａｌｅｒ Ｍ Ｌ，Ｂｕｒｇｅｒ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ— ｔｏｍ．ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｂｙ ＰＡＲ—ＣＬＩＰＥＪ］．Ｃｅｌｌ，２０１０， １４１（１）：１２９－１４１． ｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ［２７］ Ｏｒｏｍ Ｕ Ａ，Ｌｕｎｄ Ａ Ｈ．Ｉｓｏｌａｔｉｆ２２］Ｅａｓｏｗ Ｇ，Ｔｅｌｅｍａｎ Ａ Ａ，Ｃｏｈｅｎ Ｓ Ｍ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ｂｙ ｍｉＲＮＰ ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｅａｔｉｏｎ［Ｊ］． ＲＮＡ，２００７，１３（８）：１１９８—１２０４． ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈ— ｏｄｓ，２００７，４３（２）：１６２－１６５． ［２３］Ｂｅｉｔｚｉｎｇｅｒ Ｍ，Ｐｅｔｅｒｓ Ｌ，Ｚｈｕ Ｊ Ｙ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｒｇｏｎａｕｔｅ ［２８］ Ｙａｎｇ Ｊ Ｈ，Ｌｉ Ｊ Ｈ，Ｓｈａｏ Ｐ．ＳｔａｒＢａｓｅ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｅｘ－ ｐｌｏｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ—・ｍＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｐｓ ｆｒｏｍ Ａｒ—－ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２００７，４（２）：７６—８４． ［２４］Ｚｉｓｏｕｌｉｓ Ｄ Ｇ，Ｌｏｖｃｉ Ｍ Ｔ，Ｗｉｌｂｅｒｔ Ｍ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｒｅ— ｈｅｎｓｉｖｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｏｎａｕｔｅ ＣＬＩＰ—Ｓｅｑ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄｏｍｅ－Ｓｅｑ ｄａｔａ［Ｊ］。Ｎｕ— ｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１１，３９：２０２—２０９．